Práctica9: Cuantificación de una proteína sanguínea por inmunodifusión radial

OBJETIVO

 Es una técnica cuantitativa muy sensible que se utiliza a menudo para detectar los niveles de determinadas proteínas sanguíneas de los paciente.

Vamos a determinar cuantitativamente una concentración desconocida de una proteína

COMPONENTES DEL KIT

Solución anticuerpos(Conservar entre 4-8ºC) 

Solución antígeno estándar(Conservar entre 4-8ºC)

Agarosa UltraSpec(Conservar entre 4-8ºC)

Tampón en polvo(Conservar entre 4-8ºC)

Proteína de concentración desconocida(Ag)(Conservar entre 4-8ºC)

Placas de petri

2 Pipetas de 10ml

10 cortadores para pocillos

80 pipetas de transferencia

70 tubos de microtest

1 plantilla de papel

 

MATERIAL

• Micropipetas y puntas automáticas(5-50μL)
• Bombas o peras de succión de pipeta
• Regla
• Caja o plato de plástico
• Lámina de plástico para envolver (film transparente)
• Papel
• Agua destilada
• Microondas
• Frasco erlenmeyer
• vaso  o frasco de 150 ml
• Baño de agua
• Probeta graduada de 250ml
• Estufa de incubación(37ºC)

 

PROCEDIMIENTO

 

PREPARACIÓN DE LA AGAROSA

1.En un erlenmeyer, añadiremos todo el contenido del envase de tampón en polvo a 200ml de agua destilada después agitamos la solución hasta que el polvo se disuelva. De esta solución separamos y guardamos 50ml para usar como tampón de dilución en un vaso de precipitados

2. Añadir todo el contenido del paquete de agarosa al matraz con 150ml de tampón, agitamos la solución, con la ayuda de un lápiz o permanente marcamos el nivel de volumen de la solución en el matraz

Introducimos el matraz en el microondas hasta llegar al punto de ebullición pero sin dejarlo hervir, para ello cubriremos el matraz erlenmeyer con papel y calentar durante 1min, a continuación agitamos y volvemos a calentar a intervalos de 25 segundos hasta ver que la agarosa esté totalmente disuelta, la solución final debe ser clara y transparente

3. Enfriar la solución de agarosa a 50ºC en el baño de agua, iremos agitando la solución ocasionalmente mientras se enfría

 

PREPARACIÓN DE PLACAS CON AC

1.Vertemos 26ml de solución de agarosa en un tubo grande (nosotros usamos un tubo de ensayo)

2. Añadimos al tubo el contenido completo de la solución de Ac  y mezclaremos con una pipeta, mantener la solución caliente en el baño para que no solidifique antes de tiempo.

3. Con una pipeta manual de 5ml colocaremos 2,5ml en el fondo de la placa de petri extendiendo la agarosa para cubrir el fondo. Dejamos secar la agarosa para su solidificación durante 10 minutos aproximadamente

 

PREPARACIÓN CÁMARA DE INCUBACIÓN

1.Utilizamos una cubeta de plástico.

2.Añadimos en el fondo papel de manos y posteriormente agua destilada, absorbiendo todo el agua.

3.Cubrimos con film el recipiente

 

DESARROLLO DE LA PRÁCTICA

 

1. Preparamos los pocillos en las placas de agarosa, primero colocamos la plantilla debajo de la placa para que el patrón esté centrado

y realizamos los pocillos con el cortador de pocillos (pajitas o pipeta pasteur cortada)

 

2. Preparamos las soluciones estándar( dilución seriada)

Marcamos 4 tubos eppendorf :1/2,1/4,1/8 y 1/16,con una micropipeta añadimos 50 microlitros de tampón a cada tubo. Posteriormente añadimos 50 microlitros de solución antígeno estándar al tubo 1/2 y mezclamos. Con una nueva punta de pipeta transferimos 50 microlitros de la dilución 1/2 al tubo 1/4, 50 microlitro de la dilución 1/4 al tubo 1/8 y 50 microlitros del 1/8 al tubo 1/16.

En cada paso se cambia la punta de pipeta por otra nueva

 

3. Cargamos los patrones y la muestra

En los laterales de la placa enumeramos los pocillos externos del 1 al 5 dejando el central sin marcar, cargamos los pocillos del 1 al 5 con la misma micropipeta. En el pocillo 5 cargamos 5 μL de la dilución del antígeno 1/16,en el pocillo 4 cargamos 5 μL de la dilución de antígeno 1/8, en el pocillo 3 cargamos 5 μL de la dilución de antígeno 1/4, en el pocillo 2 cargamos 5 μL de la dilución de antígeno 1/2 y en el pocillo 1 cargamos 5 μL de antígeno no diluido. Con una nueva punta de micropipeta, cargamos 5 μL de la solución de proteína de concentración desconocida en el pocillo central. Marcamos en la tapa de la placa el número del grupo e iniciales y colocamos la tapa en la placa hacia arriba, la introducimos en la cámara de incubación y finalmente cubrimos

la cámara e incubamos en estufa a 37ºC o temperatura ambiente durante 24-48h

 

4. Leemos los resultados

Medimos el diámetro de los halos con una regla en milímetros.

Para realizar la curva estándar elevaremos los resultados medidos al cuadrado.

Indicaremos la concentración del Ag en el eje X y el diámetros al cuadrado en el eje Y

A partir de esta curva se puede determinar la concentración desconocida encontrando el valor del diámetro al cuadrado en el eje Y, encontrando el punto de intersección en la línea de la curva estándar y obteniendo el valor en el eje X, siendo ésta la concentración del Ag en la solución