OBJETIVO
Cuantificar proteínas plasmáticas:
- Albúmina
- Alfa1-globulinas
- Alfa2-globulinas
- Beta-globulinas
- Gamma-globulinas
MATERIAL
- Alimentador para electroforesis.
- Cubeta de electroforesis.
- Aplicador
- Tiras de acetato de celulosa.
- Láminas Mylar.
- Papel de filtro.
MUESTRA
- Suero
REACTIVOS
- Solución tampón (tris hipurato)
- Colorante rojo Ponceau.
- Decolorante rojo Ponceau.
- Solución transparentadora.
- Solución disolvente (ácido acético al 80%)
TÉCNICA
Una vez hemos abierto el envase de tiras, debemos conservar las sobrantes en una solución de metanol al 30-40%.
Preparamos el buffer para técnica semimicro tomando 100ml de tris hipurato concentrado para 1.000ml de agua destilada.
El decolorante lo preparamos disolviendo un sobre de ácido cítrico en polvo en 1.000ml de agua destilada o preparando una disolución de ácido acético al 5%.
Introducimos las tiras de en 100ml de buffer para el equilibrado de ellas.
Llenamos completamente un compartimento de la cámara e inclinamos para igualar el nivel en ambos compartimentos.
Para secar las tiras tras el buffer, las colocamos entre dos hojas de papel de filtro para retirar así el exceso de buffer. Cuando se han secado colocamos las tiras en el puente con la cara absorbente hacia arriba. Introducimos el puente en la cámara de electroforesis y aplicamos la muestra en la tira utilizando un aplicador adecuado durante unos 10 segundos.
El voltaje de la fuente de alimentación debe de ser de 200 v durante 35 minutos. Una vez pasados los 35 minutos desconectamos la fuente de alimentación y retiramos la tira para posteriormente teñirla.
Sumergimos las tiras en colorante Rojo Ponceau durante 5 minutos, a continuación las sumergimos en solución de ácido cítrico, aplicando 2 o 3 baños sucesivos hasta obtener un fondo blanco.
Cuando se han decolorado sumerjimos las tiras en el líquido transparentador durante un minuto. Llevamos la tira a la estufa a 80ºC durante 10 minutos. Al sacarla la leemos en el fotodensitómetro.
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