Práctica 6: Determinación de Hb A1c por cromatografía de intercambio iónico.

CONTENIDO Y COMPOSICIÓN

• Reactivo 1 :30 ml de biftalato potásico 50 mmol/L , detergente pH 5.0.
• Reactivo 2 : 50 ml tampón fosfatos 48 mmol/L , pH 6.5 , azida sódica 0.95 g/L
• Reactivo 3 : 450 ml , tampón fosfatos 72 mmol/L , pH 6.4 , azida sódica 0.95 g/L.
• Microcolumnas 1x20: contienen resinas de intercambio catiónio equilibrada.

MATERIAL ADICCIONAL

Fotómetro para lecturas a 415 nm (405-425).

MUESTRAS

Sangre total con heparina o EDTA como anticoagulante. Estable 10 días a 2-8ºC.

PROCEDIMIENTO

PREPARACIÓN DEL HEMOLIZADO Y ELIMINACIÓN DE LA FRACCIÓN LÁBIL

1. Dejamos atemperar los reactivos y columnas durante unos minutos, hasta que alcancen una temperatura de 21-26ºC.
2. Pipeteamos en un tubo de ensayo:
• 50 μL de sangre.
• 200 μL de reactivo 1.
3. Agitamos y lo dejamos a temperatura ambiente durante 10-15 min. Este hemolizado lo utilizamos en pasos posteriores.

PREPARACIÓN DE LA COLUMNA

Destapamos la parte superior de la columna, y sacamos el tapón inferior. Bajamos el disco superior hasta el nivel de la resina, evitando comprimirla, con la ayuda del extremo plano de una pipeta. Dejamos gotear hasta que el líquido alcance el nivel del disco, desechando el eluido.

SEPARACIÓN Y LECTURA DE LA HbA1c

1. Aplicamos sobre el disco superior 50 μL de hemolizado y desechamos el eluido.
2. Cuando haya penetrado todo el hemolizado añadimos, procurando arrastrar los posibles restos del mismo 200 μL de reactivo 2 y desechamos el eluido.
1. Dejamos gotear hasta que el rectivo 2 alcance el disco superior.

3.Pipeteamos 2 ml de reactivo 2 y desechamos el eluido.

4. Colocamos la columna sobre un tubo de ensayo y añadimos 4 ml de reactivo 3, y recogemos el eluido (fracción HbA1c).

5. Agitamos y leemos la absorbancia de la fracción HbA1c a 415 nm frente a agua destilada.

LECTURA DE LA Hb TOTAL

1. Pipeteamos en un tubo de ensayo:
• 12 ml de reactivo 3.
• 50 μL de hemolizado.
2. Agitamos y leemos la absorbancia de la Hb total a 415 nm frente a agua destilada.

CÁLCULOS

A HbA1c / 3 x A Hb total x 100 = % HbA1c

Patrón: 0,664 A

Muestra: 0,295 A

0,295 / 3 x 0,664 x 100 = 14'80% HbA1c