Práctica 5: Separación de una mezcla de aminoácidos por cromatografía en capa fina.

OBJETIVO

Realizar una separación e identificación de los aminoácidos presentes en una muestra mediante cromatografía de capa fina ascendente

MATERIALES

• Láminas de gel de celulosa
• Disolvente de cromatografía
• Disolución reveladora: Resuspender ninhidrina  en acetona a una concentración de 0,2% (p/v). Es conveniente preparar solo el volumen de la solución reveladora necesario para realizar la práctica.
• Muestra problema conteniendo una mezcla desconocida de aminoácidos
• Muestras patrón de aminoácidos
• Vaso de precipitado
• Micropipeta
• Atomizador

La muestra problema y los patrones se deben conservar congelados (-20ºC). El kit tiene una estabilidad de 2 años. La solución de ninhidrina una vez preparada caduca a los 6 meses.

PROCEDIMIENTO

1.Colocar el disolvente en el vaso de precipitado de forma que cubra el fondo hasta una altura máxima de 1cm y taparlo.

2.Coger una placa de gel de celulosa de 10x5cm. La placa se debe manipular con guantes y cogiéndola por los bordes ya que las huellas de los dedos podrían aparecer posteriormente como confusas manchas coloreadas

3.Con el mismo lápiz, marcar los puntos donde se aplicaran las muestras. Estos puntos deben estar a 1,5 cm de la base y separados entre sí 1cm. Con la placa en posición horizontal, aplicar 2µl de la muestra y patrones de aminoácidos apoyando suavemente un tubo capilar o la punta de la micropipeta sobre el punto señalado en la celulosa. Esta operación debe hacerse aplicando y secando la misma muestra varias veces, para evitar su excesiva superficie del punto de aplicación.

4.Una vez que las manchas se hayan secado al aire, introducir la placa verticalmente en la cubeta de forma que las muestras queden en la base de la cubeta. Además, siempre se debe cuidar que los puntos de aplicación queden por encima del nivel del disolvente. Poner la tapa y dejar que el disolvente suba por capilaridad durante media hora o una hora.

5.Cuando el frente haya subido aproximadamente 8cm, sacar la placa de la cubeta, marcar con un lápiz el frente del solvente (hasta donde ha llegado la fase móvil) y secar la placa al aire, con un secador de pelo o con una estufa.

6.Con la placa perfectamente seca y en posición vertical, pulverizarla con el revelador de ninhidrina. La pulverización sebe hacerse suave y uniformemente. Debe evitarse el exceso de pulverización, pero no hay que intentar quitar el revelador si se aplica demasiado. Esta operación debe hacerse en campana extractora. Si no se dispone, situarla junto a una ventana abierta y no inhalar el pulverizado.

7.Calentar la placa uno o dos minutos a 105ºC en una estufa o dejar a temperatura ambiente más tiempo. Las manchas de los aminoácidos de color rosáceo aparecerán distribuidas a lo largo del gel.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

 

Rf= distancia recorrida por el compuesto desde el origen (cm)/ distancia recorrida por el eluyente desde el origen (cm)

Rf= 1'1 cm/ 3'5 cm= 0'314 cm