Práctica 4: Cuantificación de proteínas en orina con ácido sulfosalicílico por turbidimetría.

OBJETIVO

Determinación de la cantidad de proteínas presentes en una muestra de orina, mediante turbidimetría

FUNDAMENTO

 

La adición de ácido sulfosalicílico a una solución de proteínas actúa sobre estas, dando lugar a la aparición de un fino precipitado en suspensión. Este precipitado se observa como una turbidez blanquecina cuya intensidad puede ser cuantificada por turbidimetría.

MATERIAL

• Tubos de ensayo de 5 ml y con capacidad de mas de 10 ml
• Pipetas automáticas de 200,100,50 y 25 µl
• Cubetas de fotometría
• Fotómetro

REACTIVOS

• Suero salino fisiológico (0,9 g/dl)
• Ácido sulfosalicílico al 3%(p/v)en agua destilada
• Patrón de proteínas 7 g/dl
• Albúmina bovina

MUESTRA

Sobrenadante de una muestra de orina centrifugada 5 minutos a 2000 rpm. Se puede utilizar una muestra de orina sin centrifugar.

PROCEDIMIENTO

Rotulamos los tubos de 5 ml:

• BR: blanco de reactivo
• BM: blanco de muestra
• P1: patrón 1
• P2: patrón 2
• P3: patrón 3
• P4: patrón 4
• PB1: problema 1
• PB2: problema 2

Preparamos las disoluciones en los tubos de mayor tamaño:

• D1: 1/50 (0,2 ml de patrón +  9,8 ml de SSF) → 140 mg/dl
• D2: 1/100 (0,1 ml de patrón + 9,9 ml de SSF) → 70 mg/dl
• D3: 1/200 (0,05 ml de patrón + 9,95 ml de SSF) → 35 mg/dl
• D4: 1/400 (0,025 ml de patrón + 9,975 ml de SSF) → 17,5 mg/dl

Rellenamos los tubos rotulados previamente con los datos, expresados en mL, de la siguiente tabla:

 

Agitamos por inversión, transferimos su contenido a as cubetas y seleccionamos la longitud de onda del fotómetro a 660nm

• Ajustar a cero el fotómetro con el BR
• Medir la absorbancia de P1, P2, P3 y P4
• Ajustar a cero el fotómetro con el BM
• Medir absorbancia del PB1 y PB2

RESULTADOS

 

• BR- 0,0
• P1-0,400
• P2-0,287
• P3-0,033
• P4-0,016
• BM-0,0
• PB1-0,684
• PB2-1,206

Al darnos los problemas por encima del patrón, diluimos al 1/2 y al 1/3. Finalmente queda:
 

• PB1-0,196
• PB2-0,415

Utilizamos solo el patrón 1 y el 2 debido a que los resultados del 3 y 4 son demasiado bajos.